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    2. 莊盟生物

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      RNA提取的原理與方法

      發布者:莊盟生物發布時間:2015-04-09瀏覽次數:10685次

      細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白,DNA等雜質,最終獲得高純度RNA產物的過程。

      RNA提取流程

      1.樣品處理

      從各種不同來源樣品(如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養細胞),或同一來源樣品的不同組織(如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等)中提取高質量的RNA,因細胞結構及所含的成分不同,樣品預處理的方式也各有差異。

      樣品的要求

      最好使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫(-20℃或-70℃)冷凍保存的樣品,避免反復凍融,因為這會導致提取的RNA降解和提取量下降。

      樣品預處理方式

      植物材料-液氮研磨

      動物材料-勻漿、液氮研磨

      細菌-溶菌酶破壁

      酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁

      2.細胞裂解

      異硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)

      這是一種傳統的RNA提取方法,適用于大部分動植物材料,但對于次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離,并將RNA釋放到溶液中,采用酸性酚-氯仿混合液抽提,低PH值的酚將使RNA進入水相,而蛋白質和DNA仍留在有機相,從而可以完成RNA的提取工作。

      該法應用非常廣泛,適用于包括動物組織、微生物、培養細胞等在內的各類動物性材料,同時還適用于次生代謝物較少的植物性材料,如幼苗、幼葉等。該法主要應用在動物組織和培養細胞的RNA提取中。

      胍鹽/β-巰基乙醇法

      適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。

      在這種方法中,胍鹽使細胞充分裂解,β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNaseA的活性,保護RNA不被降解。

      我公司的“GREEN”系列總RNA 提取試劑盒是基于這種方法開發的產品,分別適用于各類不同的材料。此系列產品的具體實驗步驟和適用范圍在實驗技術手冊中有詳細介紹,實驗者可根據自己的需要進行選擇。

      其它方法

      有些植物材料多糖多酚含量較高,如植物果實,番茄的葉子等,有些植物木質化程度較高,如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑,該試劑特別適合于從富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA,有關的具體步驟將在分論中詳細介紹,實驗者可根據自己的需要進行選擇。

      3. RNA純化及獲得

      純化要求

      RNA樣品中不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。

      純化方法及沉淀

      方法一:有機溶劑抽提法

      氯仿抽提

      在使用RNA提取試劑進行RNA提取時,常使用氯仿進行抽提,以去除蔗糖、蛋白等雜質,并促進水相與有機相的分離,從而達到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產品中,與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。

      沉淀

      氯仿抽提RNA后,一般采用了異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇,室溫沉淀20-30分鐘,高速離心,可獲得RNA沉淀。

      洗滌沉淀

      加入無RNase的75%乙醇,將RNA沉淀振蕩懸浮,使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心10-30分鐘。再次沉淀RNA。離心后,小心倒掉上清(注意不要倒出RNA沉淀),隨后快速離心1-2秒,將殘留在管壁上的乙醇手機到管底后,用小槍頭吸凈,超靜臺中風干1-2分鐘(注意不要晾得太干,否則RNA沉淀不易溶解)。

      溶解沉淀

      加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

      方法二:硅基質吸附法

      隨著實驗方法的改進,現已發展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有:硅基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸,使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優點,成為核酸純化的首選。

      本公司生產的總RNA提取試劑盒(ZP403-ZP407)和GREENspin系列總RNA提取試劑盒即采用硅基質吸附達到RNA分離純化目的,通過專一結合RNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統,使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結合,而蛋白、有機溶劑等雜質不能結合到膜上而被洗脫,鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌,最后用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。

      一些特殊組織的RNA提取

      纖維組織

      心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關鍵在于徹底破碎組織。這些組織細胞密度低,單位重量的組織中RNA含量較低,建議增加起始量。此外,一定要在液氮中將組織徹底磨碎。

      蛋白/脂肪含量較高的組織

      腦或植物脂肪含量高,酚/氯仿抽提后,上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對上清進行抽提。

      核酸/RNase含量高的組織

      脾、胸腺等組織的核酸和RNase含量很高,在液氮中研磨,再快速勻漿,能有效滅活RNase。如加入裂解液后變得粘稠,酚/氯仿抽提不能有效分層,則加入更多裂解液可以解決此問題。多次酚/氯仿抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成,表明可能有DNA污染,可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用Dnase1消化,去除DNA污染。

      植物組織和真菌組織

      植物組織和真菌組織比動物組織更為復雜,一般選擇在液氮條件下對樣品進行研磨,以避免內源RNase降解RNA。如果RNA降解問題不能解決,大多數情況下是樣品中含有的雜質所致。許多植物和真菌中的內含雜質和多糖、多酚等都會殘留,因為這些雜質分子與RNA有一些相似性,可與RNA同時沉淀或者吸附,因此在植物和真菌組織的提取中,需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質的干擾和污染。

      RNA評價與鑒定

      提取得到RNA溶液后,我們需要對RNA進行相關的質量檢測,以確定它是否符合后續實驗的要求。RNA用于不同的后續實驗,對其質量要求不盡相同。cDNA文庫構建要求RNA完整且無酶等抑制物殘留;Northern blot實驗對RNA完整性要求較高,對酶反應抑制物殘留要求較低;RT-PCR實驗對RNA完整性要求不太高,但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。因此在進行不同的實驗時應選擇不同的方法純化RNA,以達到最佳的實驗效果。

      RNA得率檢測—分光光度計法

      RNA得率有很強的組織特異性,不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說,可通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm處,1ug/mlRNA鈉吸光度0.025(光程為1cm),即OD260=1時,樣品中RNA濃度為40ug/ml。通常分光光度計OD260的讀數要介于0.15-1.0之間才是可靠的。因此RNA提取結束后,要根據大概產量稀釋到適當濃度范圍,再用分光光度計檢測。按下面的共識計算總RNA濃度:

      總RNA濃度(ug/ml)=OD260×稀釋倍數×40ug/ml

      RNA純度檢測---分光光度計法

      通過OD260/280來檢測RNA純度,OD260/230作為參考值。

      OD260/280在1.9-2.1之間,可以認為RNA的純度較好;

      OD260/280值小于1.8,則表明蛋白雜質較多;

      OD260/280值大于2.2,則表明RNA已經降解;

      OD260/230值小于2.0,則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。

      注意:如果用TE溶解或洗脫RNA,會使OD260/280值偏大。


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